小鼠顱頂前骨亞克隆14（MC3T3-E1Subclone 14）介紹：從克隆的但是表型各異的MC3T3-E1細胞系中分離出一系列亞克隆。 從含抗壞血酸培養(yǎng)基生長的成骨細胞中選擇高或低成骨細胞分化、礦化的亞克隆。 MC3T3亞克隆4（ATCC CRL-2593）和MC3T3亞克隆14（ATCC CRL-2594）在抗壞血酸和3到4mM無機磷酸鹽中生長表現出高水平的成骨細胞分化。 它們10天后形成一個礦化良好的細胞外基質（ECM）。MC3T3亞克隆24（ATCC CRL-2595)和MC3T3亞克隆30(ATCC CRL-2596)在抗壞血酸中生長表現出很差的成骨細胞分化。 不形成ECM， 可以作為亞克隆4和14的陰性對照。 礦化的亞克隆選擇的表達作為成骨細胞標記的mRNA，及唾液酸糖蛋白(BSP)，骨鈣素(OCN)，和甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關蛋白受體的mRNA。高或者低的分化潛能的亞克隆在培養(yǎng)中生產出相似數量的膠原質，表達可比較的基本水平的mRNA編碼Osf2/Cbfa1，一種成骨細胞相關轉錄因子。 植入免疫缺陷小鼠以后，高分化性的亞克隆形成與骨類似的形成小骨的編織骨，低分化細胞只是產生纖維組織。 這些細胞系是研究體外成骨細胞分化的好模型，尤其是ECM信號。 它們和原代培養(yǎng)顱頂成骨細胞的行為類似。

小鼠顱頂前骨亞克隆14（MC3T3-E1Subclone 14）特性

1） 來源：小鼠 顱頂骨

2） 形態(tài)：成纖維細胞，貼壁生長

3） 含量：>1x106 個/mL

4） 污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

5） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

運輸和保存

可選擇干冰運輸及發(fā)送復蘇存活細胞方式

（1）干冰運輸，收到后立即轉入液氮或者-80度冰箱凍存或直接復蘇；

（2）存活細胞，收到后應繼續(xù)生長，傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。

（3）收到細胞后請拍照，3天內如果發(fā)現污染，請及時拍照與我們聯系。

小鼠顱頂前骨亞克隆14（MC3T3-E1Subclone 14）用途：僅供科研使用。

細胞接收后的處理：

1） 收到細胞后，請檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2） 在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)時，最好在低倍鏡（4或5X物鏡)下進行，能準確判斷細胞的傳代密度。看細胞的形態(tài)請在10X和20×物鏡下，同時給剛收到的細胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細胞需要售后時提供收到細胞時細胞狀態(tài)的依據。

3） 觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h。

4） 貼壁細胞：在運輸過程中貼壁細胞會有脫落的現象，如發(fā)現貼壁細胞有脫落或者脫落后抱團生長，可將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和未貼壁細胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到加有按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基的原培養(yǎng)瓶中（或新的培養(yǎng)瓶中）。

5） 懸浮細胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基）。

6）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。  收到細胞后第一次傳代建議1：2傳代 。

小鼠顱頂前骨亞克隆14（MC3T3-E1Subclone 14）培養(yǎng)步驟

一．小鼠顱頂前骨亞克隆14（MC3T3-E1Subclone 14）培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） MEMα+培養(yǎng)基(添加NaHCO3 1.5g/L，肌醇 43.2mg/L, 葉酸 8.82mg/L,β-巰基乙醇 7.8mg/L)90%， 優(yōu)質胎牛血清10%, 雙抗1% 

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

注：第一次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據客戶需要自己定。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。

下面T25瓶為類；

1，細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數板計數。

2，4min 1000rpm 離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據細胞數量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。

3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。